同一级生物安全柜一样，气体也是从外部流入二级生物安全柜，通常称为进流。进流能够防止微生物操作时产生的气溶胶从安全柜前面操作窗口逃逸到实验室内。然而，它们不同于一级生物安全柜之处为，只让经HEPA过滤的(无菌的)空气流过工作台面。内置风机将空气经前面的开口引入安全柜内并进入前面的进风格栅。因此没有经过过滤器过滤的空气不会直接进入工作区，从而保护安全柜内部存放的样品和仪器不被外界空气所污染。
二级生物安全柜的其中一个特点就是由垂直层状薄片的(无定向的)HEPA过滤器过滤后，再安全柜内部形成向下流动的气流。气流不断地冲能可产生空气传播感染的安全柜内部，从而避面存放在柜体内的样品受到感染。这样的气流被称作下沉气流。
不同型号的二级生物安全柜的主要区别在于排气的比例以及气体经过空气高压再循环的比例不同。另外，不同的二级生物安全柜具有不同的排气方式：有的安全柜将空气过滤后直接排到室内，有的是通过连接到专用通风管道上的套管或通过建筑物的排风系统排到建筑物外面。
二级生物安全柜的主要结构：
1.顶部聚风罩（可接外排管道，选配件）；
2.无框架前窗，可提供更广阔，无障碍操作视野；
3.整块不锈钢操作台面，一体成型，方便清洁；
4.内置插座电源；
5.操作按键位于前面板中心，方便操作；
6.可选不同类型的支架（平角支架，万向轮支架，液压伸缩支架）。
二级生物安全柜的气流模式探讨：
进气流：气体流入操作台面的进气隔栅，不进入工作区域避免了样品/产品污染。
气体回流路径：进气流顺着操作台后面的回流路线向上流动并和从后面隔栅流入下沉气流相遇。此混合气体流入后面的回风腔内，然后在进入风机入口前形成负气压。风机在顶部产生正气压。如果正气压处有泄漏，此泄漏将被周围的负气压推回正气压室，从而避免泄漏。
约32%的气体经上方ULPA超高效过滤器过滤后排出，从而阻止污染物排入外界环境。剩下的68%的空气经下沉气流ULPA超高效过滤器过滤后，形成可再循环洁净气流，避免柜内产品/样品的受到污染。
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